Proizvodnja i izolovanje bioloških lekovitih supstanci (Opšti principi biotehnologije)

Biološke lekovite supstance

Biološke lekovite supstance (BLS) se značajno razlikuju od klasičnih lekovitih supstanci male molekulske mase (poput ibuprofena), kako u fizičko-hemijskim osobinama, tako i u načinu dobijanja i ponašanja u farmaceutskom obliku (preparatu u u kome se lek primenjuje) i u organizmu.

Ovi molekuli su veliki i kompleksni, degradiraju se na više načina i izuzetno su varijabilni. Jedan molekul BLS nije identičan drugom molekulu BLS, iako se oni dobijaju na isti način, pa čak i u istoj epruveti. Ova različitost BLS je nekad neophodna i namerna, na primer kod vakcina gde se na ovaj način organizam ojačati protiv više različitih mikrobnih antigena. U drugim slučajevima, heterogenost je slučajna jer je povezana sa procesom stvaranja BLS. BLS prave živi organizmi koje zovemo jedinstvena banka živih ćelija, poput bakterija, kvasca ili ćelija sisara. Nakon sinteze proteina u živom organizmu vrše se određene naknadne modifikacije poput vezivanja određenih šećera za protein koji mogu značajno uticati na neke od osobina BLS.

Ekspresioni sistemi

Biološki lekovi se najčešće dobijaju metodom rekombinantne DNK tehnologije. Proizvodi dobijeni ovom tehnologijom nastaju genetskim modifikacijama određenih organizama, poput bakterija ili kvasca, ali i ćelijskih kultura sisara (npr. ćelije jajnika kineskog hrčka). DNK molekul koji kodira stvaranje željenog proteina, u ovom slučaju proteina BLS, se mora na neki način ugraditi u DNK domaćina (ćelije koje “inficiramo” DNK molekulom za stvaranje BLS zovemo “host cells” odnosno ćelije domaćina). Korišćenjem vektora (sistema za transport DNK molekula) omogućava se nova osobina bakterije ili kvasca – da stvara željeni protein odnosno BLS. Najčešći vektori su plazmidi ili virusi. Kombinovanjem vektora i domićana nastaje ekspresioni sistem za stalno dobijanje BLS koja će se kasnije ekstrahovati i prečistiti.

Dobijanje i izolovanje BLS iz ekspresionih sistema

Dva osnovna koraka u proizvodnji BLS su 1) Upstream processing (razvoj i održavanje kultura ćelija) i 2) Downstream processing (hemijsko i fizičko odvajanje za izolovanje i prečišćavanje proizvoda iz složene smeše kultivisanih ćelija).

Ekspresioni sistemi dobijeni rekombinantnom DNK koriste se u dugom periodu za dobijanje BLS. U proizvodnji BLS postoje dve grupe kultura ćelija ekspresionog sistema. Master Cell Bank (banka master ćelija) čini jedna suspenzija originalnih ćelija ekspresionog sistema (domaćinska ćelija čija je DNK zamenjena vektorskom DNK). Ona je raspoređena u jednakim zapreminama u različite kontejnere (posude) za skladištenje. Ove ćelije imaju određeni broj deoba kroz koje treba da prođu kako bi postale working cell bank (banka radnih ćelija). Radne ćelije se takođe raspodeljuju u posude istih zapremina i skladište. Jednom kada se bilo koja grupa ovih ćelija povuče iz skladišta, ne može se ponovo vratiti. Stoga je neophodno da master ćelije daju radne ćelije koje će se koristiti za stvaranje BLS u dugom vremenskom periodu kroz neki određeni broj deoba od trenutka izolovanja (“finite passage level”).

Preliminarno prečišćavanje vrši se centrifugiranjem, filtracijom i membranskom filtracijom. Izolovanje (“capture step”) i uklanjanje nečistoća vrši se afinitetnom hromatografijom. Virusi se inaktiviraju i uklanjaju filtracijom. Nakon toga sledi ultrafiltracija radi smanjivanja zapremine medijuma sa proteinom i prebačaj proizvoda u rastvor pufera koji kasnije ulazi u sastav finalne formulacije leka.

BLS se čuvaju na niskoj temperaturi koja redukuje procese denaturacije i rast mikroorganizama. Koriste se posude glatkih staklenih zidova radi smanjivanja mogućnosti da se protein adsorbuje na sud ili taloži. Tamni zidovi posuda štite od svetlosti i fotooksidacije BLS. U pufer sa BLS mogu se dodati soli za stabilizaciju, polioli kao solubilizatori da im povećaju rastvorljivost, šećeri ili dekstrani da bi vezali vodu i umanjili rast mikroorganizama i površinski aktivne materije da umanje adsorpciju za sud i agregaciju više molekula proteina. Sušenje smrzavanjem najbolje uklanja vodu iz proteina, ponekad i toliko da spreči denaturaciju nekih proteina. 

Literatura

Abhinav A.Shukla, UweGottschalk, Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing, Trends in Biotechnology, Volume 31, Issue 3, March 2013, Pages 147-154

Ph. Eur. 9 - monografija o proizvodnji bioloških molekula

Autor: Veljko Cvetković